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現(xiàn)代生物技術綜合實訓

現(xiàn)代生物技術綜合實訓

作者：嚴林俊
出版社：中國環(huán)境出版出版時間：2016-04-01
開本： 16開 頁數： 50
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現(xiàn)代生物技術綜合實訓 版權信息

  • ISBN：9787511127402
  • 條形碼：9787511127402 ; 978-7-5111-2740-2
  • 裝幀：暫無
  • 冊數：暫無
  • 重量：暫無
  • 所屬分類：>

現(xiàn)代生物技術綜合實訓 內容簡介

　　《現(xiàn)代生物技術綜合實訓》以基因工程、蛋白工程實驗為基礎，組成了生物工程中上游和下游技術。以綠色熒光蛋白的克隆、轉化和原核表達作為一個整體實驗，放棄了原先實訓模式中單獨小實驗的結構，而改為一個獨立的大實驗，增強了學生的設計能力和主動性。這些實驗既注重和加強了原來各自的實驗內容，又注意到相互聯(lián)系！　　冬F(xiàn)代生物技術綜合實訓》內容分為兩個模塊：*一模塊包括基因工程的基本理論以及相應的實踐操作；第二模塊包括蛋白質工程的基本技術和實用技能綜合性實驗。這些實驗采取大實驗方法，使學生有一個完整的操作過程，對理解生物工程的上游、中游和下游技術有了感性認識。

現(xiàn)代生物技術綜合實訓 目錄

模塊一 基因工程
項目一 質粒DNA的抽提
項目二 瓊脂糖凝膠電泳
項目三 PCR擴增
項目四 DNA片段的回收及純化
項目五 大腸桿菌化學感受態(tài)的制備及轉化
項目六 外源DNA片段的定向克隆

模塊二 蛋白質工程
項目一 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
項目二 外源基因在大腸桿菌中的表達
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現(xiàn)代生物技術綜合實訓 節(jié)選

　　《現(xiàn)代生物技術綜合實訓》：　　質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取是*常用、*基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒的抽提過程！　∫弧嶒災康摹　×私鈮A裂解法制備質粒的原理，掌握質粒小抽的傳統(tǒng)方法和商業(yè)化柱層析方法！　《、實驗原理　　從細菌（如大腸桿菌或枯草桿菌）中提取DNA的方法很多，其分離原理可根據.DNA分子大小的不同、堿基組成的差異以及質粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀結構的特點來進行。目前常用的有堿變性法、酸酚法、PEG法、煮沸法以及溴化乙錠一氯化銫梯度離心法。這些方法各有利弊，有的操作煩瑣，難以控制，有的純度不夠，有的需要昂貴的儀器。而堿變性法被認為是一種既經濟，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用這種方法提取的DNA可用于酶切、連接和轉化！　A變性法提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)結構的兩條互補鏈不能完全分離，當以pH為4.8的NaAC緩沖液調節(jié)其pH至中性時，變性的質粒.DNA又恢復到原來的構型，保存于溶液中，而染色體DNA不能復性，形成纏連的網狀結構，通過離心與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白.SDS復合物等一起沉淀下來而去除，從而達到分離的目的。后面可以采用傳統(tǒng)的酚+氯仿抽提，酸性、低離子強度時超螺旋DNA在水相中，開環(huán)、線型分子在酚相中進行分離的酸酚法；利用商業(yè)化DNA結合柱只吸附DNA進行分離純化！　。ㄒ唬┝呀饧毎　×呀饧毎侵竿ㄟ^溶菌酶、去污劑等試劑破裂細胞壁與膜的過程。對于不同的菌要選用不同的方法，通常有煮沸法、非離子型去污劑法、堿性SDS法（簡稱堿法）等。三種方法比較而言，非離子型去污劑法較溫和，適用于抽提10kb左右的質粒；而煮沸法與堿性SDS法相對較劇烈，只能抽提小于10kb的質粒。常用的離子型去污劑是SDS、非離子型去污劑有Tritonx-100等！　。ǘ┓蛛x　　將質粒DNA和細菌染色體DNA進行分離。堿裂解法的分離原理如下：大腸桿菌的染色體約有4700kb長，在處理細胞過程中都斷裂成不同長度的雙鏈DNA片段。在pH高達12的堿性條件下，雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA的雙鏈分離成單鏈；而呈超螺旋狀態(tài)的質粒DNA僅僅是氫鍵被破壞，并只發(fā)生部分雙鏈解離成單鏈的變化。再當pH調回中性時，單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質結合生成網絡狀大分子，而超螺旋的質粒發(fā)生復性反應后仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達到分離的目的。　。ㄈ┘兓　〖毎呀庖褐械碾s質除了染色體DNA外還有各種細胞壁、膜碎片、蛋白質、脂質類物質及RNA。純化的步驟就是有針對性地將它們去除，RNA可用。RNaseA消化。其他雜質可用傳統(tǒng)的采酚一氯仿方法抽提除去，殘余的蛋白質可通過酚、酚.氯仿、氯仿一異戊醇，使蛋白質變性而除去，同時，氯仿有強烈的溶脂傾向，對于在除去蛋白質的同時去除脂質類雜質很有好處。氯仿還能將微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚對于以后的酶切、轉化等過程都會產生不利影響。氯仿／異戊醇的蛋白質變性能力較弱，主要用于含酚試劑處理后的抽提。除了傳統(tǒng)方法，現(xiàn)代生物技術發(fā)展，各種質粒小抽商業(yè)化試劑盒出現(xiàn)，使用DNA.的結合柱結合質粒DNA，同時去除雜質，*終獲得純化高的質粒DNA！　　

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