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植物生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)

植物生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)

出版社：科學(xué)出版社出版時(shí)間：2021-06-01
開(kāi)本： 24cm 頁(yè)數(shù)： 118頁(yè)
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植物生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn) 版權(quán)信息

植物生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn) 內(nèi)容簡(jiǎn)介

本教材針對(duì)教材中的3個(gè)模塊: 分子標(biāo)記技術(shù)與基因定位、基因克隆與載體構(gòu)建、植物組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化, 設(shè)計(jì)綜合實(shí)驗(yàn), 以達(dá)到加強(qiáng)鞏固理論知識(shí)的目的。通過(guò)綜合實(shí)驗(yàn)鍛煉學(xué)生大局科研思維和實(shí)驗(yàn)技能。本書(shū)通過(guò)綜合性實(shí)驗(yàn)可以鍛煉學(xué)生實(shí)踐動(dòng)手能力、創(chuàng)新性思維能力、獨(dú)立分析問(wèn)題能力及團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力, 培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)探索精神。

植物生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn) 目錄

目錄
前言
綜合實(shí)驗(yàn)一 突變體的遺傳分析及基因定位 1
實(shí)驗(yàn)一 擬南芥種植、生長(zhǎng)發(fā)育及雜交 2
實(shí)驗(yàn)二 rrg短根突變體的觀察及遺傳分析 6
實(shí)驗(yàn)三 植物基因組
DNA的提。–TAB法）和凝膠檢測(cè) 10
實(shí)驗(yàn)四 Bulk DNA PCR擴(kuò)增（SSR技術(shù)） 16
實(shí)驗(yàn)五 Bulk DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE檢測(cè)（SSR技術(shù)） 21
實(shí)驗(yàn)六 擬南芥F2大群體DNA的PAGE檢測(cè)結(jié)果分析 25
實(shí)驗(yàn)七 作圖與QTL分析軟件的使用 28
綜合實(shí)驗(yàn)二 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 35
實(shí)驗(yàn)八 細(xì)菌培養(yǎng)基及其配制 36
實(shí)驗(yàn)九 目標(biāo)基因引物的設(shè)計(jì) 38
實(shí)驗(yàn)十 目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增 42
實(shí)驗(yàn)十一 載體的選擇和質(zhì)粒的提取 44
實(shí)驗(yàn)十二 質(zhì)粒載體的酶切及與PCR產(chǎn)物的連接 49
實(shí)驗(yàn)十三 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 53
實(shí)驗(yàn)十四 重組子的篩選及鑒定 56
實(shí)驗(yàn)十五 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 59
綜合實(shí)驗(yàn)三 植物遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測(cè) 65
實(shí)驗(yàn)十六 植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備 66
實(shí)驗(yàn)十七 棉花愈傷組織的誘導(dǎo)及形態(tài)觀察 69
實(shí)驗(yàn)十八 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化 72
實(shí)驗(yàn)十九 植物原生質(zhì)體的分離和純化 82
實(shí)驗(yàn)二十 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽(yáng)性檢測(cè) 87
實(shí)驗(yàn)二十一 轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交分析 90
實(shí)驗(yàn)二十二 轉(zhuǎn)基因植株RNA提取及檢測(cè) 95
實(shí)驗(yàn)二十三 轉(zhuǎn)基因材料的RT-PCR檢測(cè) 99
實(shí)驗(yàn)二十四 轉(zhuǎn)基因植株Northern 雜交分析 101
實(shí)驗(yàn)二十五 植物蛋白質(zhì)的提取與濃度測(cè)定 105
實(shí)驗(yàn)二十六 轉(zhuǎn)基因植株Western雜交分析 109
參考文獻(xiàn) 113
附錄 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的溶液配方 115
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植物生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn) 節(jié)選

綜合實(shí)驗(yàn)一 突變體的遺傳分析及基因定位 一、綜合實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本綜合實(shí)驗(yàn)以基因克隆的原理與方法為依據(jù)，設(shè)計(jì) 7個(gè)分實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)彼此聯(lián)系并且呼應(yīng)。從擬南芥的種植與雜交開(kāi)始，依次完成表型、基因型數(shù)據(jù)的獲取，從而*終定位到突變基因在染色體上的位置。這一綜合性實(shí)驗(yàn)可以幫助學(xué)生掌握表型測(cè)定、DNA提取、PCR和 PAGE凝膠電泳、數(shù)量性狀基因座（QTL）作圖的原理和方法。同時(shí)，也可以讓學(xué)生從一個(gè)整體的角度審視這一綜合實(shí)驗(yàn)，清楚每個(gè)實(shí)驗(yàn)間的聯(lián)系和實(shí)驗(yàn)?zāi)康，從而培養(yǎng)學(xué)生的全局觀。 二、綜合實(shí)驗(yàn)原理 1．基因定位的基本原理 基因定位是指利用標(biāo)記技術(shù)將基因定位在某一特定的染色體上，確定基因在染色體上線性排列的順序和位置。利用未知基因與已知標(biāo)記基因之間的連鎖率 /交換率，將未知基因定位在特定染色體的目標(biāo)區(qū)間內(nèi)，位于兩個(gè)盡量近的標(biāo)記基因之間。 2．BSA法的基本原理 分離體分組混合分析法又稱混合分組分析法（bulked segregant analysis，BSA法），首先從一對(duì)攜帶目標(biāo)基因且具有表型差異的親本所產(chǎn)生的分離群體中，根據(jù)目標(biāo)基因的表型分別選取一定數(shù)量的植株，構(gòu)成兩個(gè)亞群或集團(tuán)。將每個(gè)亞群的 DNA等量混合，形成兩個(gè)相對(duì)性狀的“基因池”（gene pool），然后用合適的分子標(biāo)記對(duì)兩個(gè)基因池進(jìn)行分析，獲得與目標(biāo)性狀基因座位連鎖的多態(tài)性分子標(biāo)記。在獲得了與目標(biāo)基因相連鎖的分子標(biāo)記以后，可以利用某一作圖群體進(jìn)行分析以便進(jìn)一步檢測(cè)所得分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀基因的連鎖程度，以及其在某已知分子圖譜中或染色體上的位置，這樣才能完成真正意義上對(duì)基因的標(biāo)記定位，如下圖所示。由于建池時(shí)使用了特定的分離群體，并且在分組時(shí)僅對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，這樣可以保證其他性狀的遺傳背景基本相同，兩個(gè)基因池之間理論上主要在目標(biāo)基因區(qū)段存在差異，因此兩基因池又被稱為近等基因池，這就排除了環(huán)境及人為因素的影響，使研究結(jié)果更為準(zhǔn)確、可靠。 BSA法克服了很多作物難以得到近等基因系的困難，并且比近等基因系法省時(shí)、省力，是一種非常實(shí)用的基因標(biāo)記定位的方法，應(yīng)用非常廣泛。 三、綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如左圖所示。 實(shí)驗(yàn)一　擬南芥種植、生長(zhǎng)發(fā)育及雜交 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1．了解擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的基本條件和基本生物學(xué)特征。 2．通過(guò)學(xué)習(xí)控制光、溫等條件來(lái)培養(yǎng)模式植物擬南芥。 3．掌握擬南芥的種植方法及雜交的過(guò)程與方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 擬南芥（ Arabidopsis thaliana）屬被子植物門(mén)雙子葉植物綱十字花科植物，擬南芥基因組大約有 12 500萬(wàn)堿基對(duì)和 5對(duì)染色體。擬南芥的優(yōu)點(diǎn)是植株小、結(jié)子多，為自花授粉植物，基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型植株。因此，擬南芥是進(jìn)行遺傳學(xué)研究的好材料，被科學(xué)家譽(yù)為“植物中的果蠅”。 1．　　播種和發(fā)芽 將播有種子的容器移至相應(yīng)低溫條件下，在 2～4℃下放置 2～4 d，從而在吸脹條件下破除種子休眠，這對(duì)新鮮收獲的擬南芥種子來(lái)說(shuō)尤為必要。大多數(shù)擬南芥品系的種子是中度休眠的，收獲已久的這類(lèi)生態(tài)型的擬南芥種子可免于低溫處理，而有些生態(tài)型甚至需長(zhǎng)達(dá)7 d 的低溫處理。干種子的低溫處理往往是無(wú)效的。低溫處理后，將容器移至溫室或生長(zhǎng)室，在22℃左右培養(yǎng)發(fā)芽，夜溫可比日溫低2℃，用2000 lx 的熒光燈給予光照，光周期為8 h 光/6 h 暗（也可24 h 光照），在5 d 左右可見(jiàn)擬南芥發(fā)芽。擬南芥發(fā)芽需光，故應(yīng)防止種子被土覆蓋。 2．生長(zhǎng)發(fā)育條件的控制 擬南芥一般是冬性一年生植物，自然條件下種子在秋天發(fā)芽，幼年期在冬天度過(guò)，花分生組織在春季分化，種子在夏季成熟脫落。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室栽植的擬南芥品種在發(fā)芽4 周后開(kāi)花，而在開(kāi)花后4～6 周內(nèi)采集種子。不同生態(tài)型擬南芥的發(fā)育進(jìn)程、開(kāi)花時(shí)間、成熟時(shí)間等除了取決于遺傳性以外，也受外界環(huán)境條件的影響。 1）光 光對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響涉及光強(qiáng)度和光周期兩個(gè)方面。從光強(qiáng)度方面來(lái)說(shuō)，在生長(zhǎng)室中一般*適合的光強(qiáng)度為120～150 μmol/（m2 s），這可通過(guò)熒光燈配以白熾光來(lái)達(dá)到。在夏天溫室中，60% 遮陰有助于光強(qiáng)控制和溫度調(diào)節(jié)，較老植株可以忍受高光強(qiáng)或直接太陽(yáng)光照射，而年幼植株則應(yīng)避免強(qiáng)光。 擬南芥在連續(xù)照光和長(zhǎng)日照下開(kāi)花速度加快，短日照時(shí)開(kāi)花過(guò)程被阻遏或延遲，這表明擬南芥開(kāi)花需要長(zhǎng)日照，光周期一般為12 h 光/12 h 暗。冬季在溫室中可補(bǔ)充早晚的光照，以滿足光周期需要，一般以16 h 光照、8 h 暗期為宜。連續(xù)光照可促進(jìn)生殖生長(zhǎng)，略微提早開(kāi)花，但使葉數(shù)減少及種子生成量降低，而較短日照有利于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。 2）溫度 擬南芥的*適生長(zhǎng)溫度為25℃，稍低的溫度也是允許的。當(dāng)水分供應(yīng)充足時(shí)，植物甚至能在溫度高達(dá)34℃時(shí)生長(zhǎng)，但會(huì)減少受精。雖然較老的植株能忍受高溫，但保持25℃對(duì)整個(gè)植株生長(zhǎng)周期是有利的。當(dāng)種子形成時(shí)，生長(zhǎng)室溫度宜設(shè)定在25℃，夜溫比日溫低2～4℃為宜。 對(duì)于許多遲開(kāi)花的擬南芥生態(tài)型來(lái)說(shuō)，幼苗期要在4℃左右處理一個(gè)時(shí)期（如幾周），以完成春化作用，從而在長(zhǎng)日照下促進(jìn)開(kāi)花。而對(duì)于常用的擬南芥生態(tài)型，如Landsberg erecta（Ler）和Columbia 則不需春化處理就能開(kāi)花。必須注意這里的低溫春化處理不同于播種時(shí)破除休眠的低溫處理，破除休眠的低溫處理又稱層積處理（stratification）。 3）水分 在種子發(fā)芽后的頭幾周里，理想的供水是來(lái)自土壤毛細(xì)管由下至上的滲水，只有當(dāng)土壤呈現(xiàn)干旱時(shí)才適時(shí)灌水。過(guò)量供水會(huì)引起土表藻類(lèi)和真菌的生長(zhǎng)。在擬南芥頭兩片真葉開(kāi)始伸展之前必須避免干旱，當(dāng)真葉長(zhǎng)出后，灌水頻率可相應(yīng)減少，如每周一或兩次。而在角果充實(shí)階段必須保證水分供應(yīng)，以利于種子形成。在角果成熟階段澆水時(shí)*好待90% 左右的穴盤(pán)或花盆干燥之后進(jìn)行。土壤供水狀況會(huì)影響擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育。濕度的增加（如 50%～60%）會(huì)大大減少土表干旱的影響以及發(fā)芽幼苗脫水的危害，但一般來(lái)說(shuō)，擬南芥植株包括幼苗都能忍受低濕度。處在蓮座狀階段的植株可在不同濕度下生長(zhǎng)，當(dāng)長(zhǎng)角果進(jìn)入成熟階段時(shí)，較低濕度（如＜50%）是有利的。 4）營(yíng)養(yǎng) 正常情況下無(wú)須供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但是貧瘠的營(yíng)養(yǎng)狀況會(huì)降低植株高度，使它提早開(kāi)花，并使種子著生減少。在生長(zhǎng)發(fā)育的后期階段補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)促進(jìn)種子著生，并產(chǎn)生較健壯的植株。當(dāng)植株呈現(xiàn)出輕微淡綠色時(shí)，表明營(yíng)養(yǎng)供給不足，應(yīng)立即施以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，正常健壯的擬南芥植株是亮暗綠色的。 5）防止雜交 擬南芥是自花授粉植物，為了保持?jǐn)M南芥品系的純化，必須防止溫室或生長(zhǎng)室中各品系之間的雜交。為此可根據(jù)各自實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行設(shè)置，如保持生長(zhǎng)環(huán)境的清潔，從而切斷經(jīng)昆蟲(chóng)媒介而導(dǎo)致的雜交途徑。栽植時(shí)注意各品系之間的種植距離（如 20 cm），從而防止不同品系的花互相接觸。在長(zhǎng)成植株后，可采取適當(dāng)措施，防止植株倒伏，避免互相接觸。 因此，人為恰當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)光照和溫度等條件是很好地控制擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵。低溫和長(zhǎng)日照都有利于擬南芥的開(kāi)花。如果希望擬南芥具有良好的營(yíng)養(yǎng)體，則可通過(guò)適當(dāng)縮短光照時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)；如果想使擬南芥的生育期提前，可以通過(guò)適當(dāng)密植或延長(zhǎng)光照時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。 三、材料與用品 1．實(shí)驗(yàn)材料 Ler生態(tài)型擬南芥種子（野生型）、rrg短根突變型擬南芥種子（突變型）。 2．實(shí)驗(yàn)器具 小濾紙條、鑷子、蛭石、田園土、一次性塑料杯子、雜交袋、托盤(pán)、光照培養(yǎng)箱等。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．?dāng)M南芥的種植 （1）將蛭石和田園土按 1∶1混合，裝入底部戳 4或 5個(gè)小孔的一次性塑料杯子內(nèi)。 （2）將上述準(zhǔn)備的盛有混合土的杯子放到托盤(pán)中。 （3）取小濾紙條對(duì)折并撮少許 Ler生態(tài)型擬南芥種子和 rrg短根突變型擬南芥種子，然后均勻地撒在沙土的表面，每種種子各自種一杯。 （4）待所有的種子都播種完成之后，用自來(lái)水澆灌直到一次性杯子內(nèi)沙土的上表面完全被水浸濕為止。 （5）將播種并澆灌完成的一次性杯子連同托盤(pán)一起放到光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為22℃，光照時(shí)間為每天12 h。 （6）適時(shí)澆水、觀察（圖1-1）。 圖1-1　擬南芥的生育期 A．1 周2 片真葉幼苗；B．2 周4 片真葉幼苗；C．3 周8 片真葉幼苗；D．4 周抽薹前期幼苗；E．5 周抽薹期成株；F．盛花期成株；G．花；H．花絮；I．種子 2．?dāng)M南芥的有性雜交 （1）選擇母本：選擇剛剛能看見(jiàn)一點(diǎn)白色花苞的擬南芥作為母本。 （2）去雄：用消毒好的鑷子小心去掉母本花的花萼（綠色部分），隨后去掉花瓣（白色部分），*后去掉雄蕊（呈微黃色）。 （3）選擇父本：選擇花完全展開(kāi)，呈十字狀，雄蕊花藥完全成熟（花藥很黃，裂開(kāi)有花粉）的擬南芥作為父本。 （4）人工授粉：用鑷子夾住雄蕊柄部取下，在去雄后的母本花柱頭上輕輕擦拭數(shù)次，套好雜交袋，并做好標(biāo)記（包括父本、母本、雜交日期等）。注意：授粉*好在上午10 點(diǎn)之前進(jìn)行；母本花去雄后1～2 d 授粉皆可。 （5）觀察記錄：2～3 d 后，如果柱頭正在發(fā)育膨大，則表明雜交成功（圖1-2）。 五、注意事項(xiàng) 1．選擇母本時(shí)，一定要選用花苞適中的花朵作為母本；ò^(guò)小，可能無(wú)法授粉，也不便于后續(xù)操作；花苞過(guò)大，可能已經(jīng)散粉而無(wú)法進(jìn)行雜交。 2．母本去雄時(shí)，操作過(guò)程不要弄傷、弄折柱頭及花莖，否則花將無(wú)法正常授粉、發(fā)育，*終無(wú)法得到雜交種子。 圖 1-2　擬南芥雜交過(guò)程示意圖粉、發(fā)育，*終無(wú)法得到雜交種子。 3．選擇父本時(shí)，盡量選擇較大、已經(jīng)散粉但閉合的花苞，避免外界花粉的干擾而形成不知親本來(lái)源的雜交后代。 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 1．記錄出芽時(shí)間、長(zhǎng)出真葉時(shí)間以及開(kāi)花的時(shí)間。 2．統(tǒng)計(jì)雜交的成功率。 七、思考題 如果想使擬南芥盡快開(kāi)花，如何調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件？ 實(shí)驗(yàn)二　rrg短根突變體的觀察及遺傳分析 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1．進(jìn)行相對(duì)性狀的觀察，掌握判斷顯性性狀和隱性性狀的方法。 2．掌握質(zhì)量性狀的遺傳分析方法和基本原理。 3．掌握擬南芥無(wú)菌苗的種植方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 1．顯隱性的判定 兩親本雜交得到 F1后代，通過(guò)觀察親本、 F1植株的表型來(lái)判定性狀的顯隱性。本實(shí)驗(yàn)中， rrg突變體表現(xiàn)為短根表型，野生型表現(xiàn)為正常根表型。若 F1植株表現(xiàn)為正常根表型，則突變?yōu)殡[性突變；若 F1植株表現(xiàn)為突變短根表型，則突變?yōu)轱@性突變。

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